Podpis ekspresji genowej jako predyktor przeżycia w raku piersi cd

Ocena histologiczna została oceniona zgodnie z metodą opisaną przez Elstona i Ellisa13; inwazję naczyniową oceniano jako nieobecną, niewielką (od jednego do trzech naczyń) lub większą (więcej niż trzy naczynia). Izolacja profilowania ekspresji RNA i mikromacierzy
Izolację RNA, znakowanie komplementarnego RNA (cRNA), hybrydyzację znakowanego cRNA z 25000-genowymi macierzami i ocenę proporcji ekspresji przeprowadzono w sposób opisany uprzednio. 9,14 W skrócie, materiał nowotworowy został szybko zamrożony w ciekłym azocie. w ciągu godziny po operacji. Zamrożone skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną; wybrano jedynie próbki, które miały więcej niż 50% komórek nowotworowych. Trzydzieści 30-.m przekroje zostały użyte do izolacji RNA. Całkowity RNA wyizolowano za pomocą RNAzolB i rozpuszczono w wodzie wolnej od RNazy. Następnie 25 .g całkowitego RNA traktowano DNazą za pomocą zestawu DNazy wolnego od RNazy wolnego od Qiagen i kolumn wirów RNeasy, RNA rozpuszczono w wodzie wolnej od RNazy do końcowego stężenia 0,2 .g na mikrolitr, a cRNA wytworzono przez transkrypcja in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 i 5 .g całkowitego RNA i znakowane Cy3 lub Cy5 (Cy Dye, Amersham Pharmacia Biotech). Pięć mikrogramów cRNA znakowanego cyjanem z jednego nowotworu sutka zostało zmieszane z taką samą ilością produktu znakowanego cyjanem o odwróconych kolorach z puli, która składała się z równej ilości cRNA od każdego pacjenta.
Wyznakowane cRNA fragmentowano do średniej wielkości około 50 do 100 nukleotydów przez ogrzewanie próbek do 60 ° C w obecności 10 mM chlorku cynku i dodawanie buforu do hybrydyzacji zawierającego M chlorek sodu, 0,5% sarkozyny sodu, 50 mM morfoliny. kwas etanosulfonowy (pH 6,5) i formamid (stężenie końcowe, 30 procent w 40 ° C); końcowa objętość wynosiła 3 ml. Mikromacierze zawierały 24 479 oligonukleotydów biologicznych, jak również 1281 sond kontrolnych. Po hybrydyzacji szkiełka zostały przemyte i zeskanowane za pomocą konfokalnego skanera laserowego (Agilent Technologies). Zmierzono intensywności fluorescencji skanowanych obrazów, a wartości skorygowano na poziomie tła i znormalizowano.
Strategia walidacji
Chcieliśmy zbadać wartość prognostyczną profilu ekspresji genu w kolejnych seriach pacjentów z rakiem piersi. Do badania włączono 61 z 78 pacjentów z ujemną chorobą węzłów chłonnych, którzy byli zaangażowani w poprzednie badanie, które określiło profil prognostyczny 70-genu.9 Pozostawienie ich spowodowałoby błąd w selekcji, ponieważ poprzednie badanie obejmowało nieproporcjonalnie dużą liczbę pacjentów. pacjentów, u których odległe przerzuty wystąpiły w ciągu pięciu lat. W badaniu uwzględniliśmy tych 61 pacjentów, ale zastosowaliśmy klasyfikację krzyżową potwierdzoną krzyżowo, ustaloną w poprzednim badaniu, aby przewidzieć wyniki wśród tych pacjentów. W tym podejściu klasyfikacja pominiętej próbki opierała się na korelacji ze średnimi poziomami ekspresji pozostałych próbek od pacjentów z dobrą sygnaturą prognostyczną, przy czym dana próbka została wykluczona z procesu selekcji genów. 9 Podejście to minimalizuje do pewnego stopnia możliwość przeszacowania wartości profilu prognostycznego, przy jednoczesnym zachowaniu kolejnych serii
[przypisy: psycholog warszawa ursynów, nfz katowice przeglądarka skierowań, morfologia koszt ]
[hasła pokrewne: definicja zdrowia wg who, przygotowanie do badania pet, olx dęblin ]